La edición del genoma es prometedora para corregir mutaciones patogénicas. Sin embargo, es difícil determinar los efectos fuera del objetivo de la edición debido a polimorfismo de un solo nucleótido en individuos. Desarrollamos un método llamado GOTI (análisis del genoma fuera del objetivo mediante inyección de embriones de dos células) para detectar mutaciones fuera del objetivo mediante la edición de un blastómero de embriones de ratón de dos células que utilizan CRISPR-Cas9 o editores de base. La comparación de las secuencias genómicas completas de las células de la progenie de blastómeros editados y no editados en E14.5 mostró que las variantes de nucleótidos únicos (SNV) fuera del objetivo eran raras en los embriones editados por CRISPR-Cas9 o editor de bases de adenina, con un cierre de frecuencia A la tasa de mutación espontánea. En contraste, la edición de la base de citosina indujo SNV con frecuencias 20 veces más altas, lo que requiere una solución para abordar su fidelidad.

Genome editing holds promise for correcting pathogenic mutations. However, it is difficult to determine off-target effects of editing due to single nucleotide polymorphism in individuals. Here, we developed a method named GOTI (Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection) to detect off-target mutations by editing one blastomere of two-cell mouse embryos using either CRISPR-Cas9 or base editors. Comparison of the whole genome sequences of progeny cells of edited vs. non-edited blastomeres at E14.5 showed that off-target single nucleotide variants (SNVs) were rare in embryos edited by CRISPR-Cas9 or adenine base editor, with a frequency close to the spontaneous mutation rate. In contrast, cytosine base editing induced SNVs with over 20-fold higher frequencies, requiring a solution to address its fidelity.

Los Editores base de citosina y adenina (CBE y ABE), son herramientas nuevas y prometedoras para lograr los cambios genéticos precisos requeridos para el tratamiento de enfermedades y mejora de rasgos. Sin embargo, todavía hace falta un estudio de asociación de genoma y un análisis imparcial de sus efectos fuera del objetivo in vivo. Nuestro análisis de la secuenciación del genoma completo (WGS) de las plantas de arroz tratadas con BE3, BE3 de alta fidelidad (HF1-BE3), o ABE reveló que BE3 y HF1-BE3, pero no ABE, inducen mutaciones sustanciales en todo el genoma, el cual en su mayoría son del tipo CàT de variantes de un solo nucleótido (SNV) y parecen estar enriquecidas en ciertas regiones genéticas. Notablemente, el tratamiento del arroz con BE3 o HF1-BE3 en ausencia de ARN de guía única también resulta en el aumento de estas mutaciones de un solo nucleótido en todo el genoma. Por lo tanto, la unidad de edición base de BE3 o HF1-BE3 debe ser optimizada con el fin de alcanzar una fidelidad alta.

Cytosine and adenine base editors (CBEs and ABEs) are promising new tools for achieving the precise genetic changes required for disease treatment and trait improvement. However, genome-wide and unbiased analyses of their off-target effects in vivo are still lacking. Our whole genome sequencing (WGS) analysis of rice plants treated with BE3, high-fidelity BE3 (HF1-BE3), or ABE revealed that BE3 and HF1-BE3, but not ABE, induce substantial genome-wide off-target mutations, which are mostly the C?T type of single nucleotide variants (SNVs) and appear to be enriched in genic regions. Notably, treatment of rice with BE3 or HF1-BE3 in the absence of single-guide RNA also results in the rise of genome-wide SNVs. Thus, the base editing unit of BE3 or HF1-BE3 needs to be optimized in order to attain high fidelity.

La herramienta de edición genómica CRISPR-Cas9 permite modificaciones accesibles y eficientes que reactivaron la investigación molecular en ciertas especies. Sin embargo, la integración de fragmentos de ADN largos usando CRISPR-Cas9 aún es desafiante en numerosos modelos de investigación. Para comparar sistemáticamente la eficiencia de CRISPR-Cas9 respecto de la recombinación homóloga clásica (cHR) para la inserción de fragmentos de ADN largos, realizamos y analizamos 221 experimentos dirigidos hacia 128 loci en células ES de ratón. Aunque ambas tecnologías mostraron ser eficientes, CRISPR-Cas9 produjo significativamente más clones positivos, detectados por PCR de superposición. También produjo reordenamientos inesperados alrededor del sitio blanco, siendo el sistema CRISPR-Cas9 en última instancia menos eficiente que la cHR para la producción de clones completamente validados. Los datos muestras que la recombinación mediada por CRISPR-Cas9 puede inducir modificaciones complejas de largo alcance en el loci blanco, lo cual enfatiza la necesidad de una caracterización detallada de cualquier material modificado mediante la edición genómica por CRISPR-Cas9, antes de cualquier estudio funcional o uso terapéutico.

The CRISPR/Cas9 gene editing tool enables accessible and efficient modifications which (re)ignited molecular research in certain species. However, targeted integration of large DNA fragments using CRISPR/Cas9 can still be challenging in numerous models. To systematically compare CRISPR/Cas9 s efficiency to classical homologous recombination (cHR) for insertion of large DNA fragments, we thoroughly performed and analyzed 221 experiments targeting 128 loci in mouse ES cells. Although both technologies proved efficient, CRISPR/Cas9 yielded significantly more positive clones as detected by overlapping PCRs. It also induced unexpected rearrangements around the targeted site, ultimately rendering CRISPR/Cas9 less efficient than cHR for the production of fully validated clones. These data show that CRISPR/Cas9-mediated recombination can induce complex long-range modifications at targeted loci, thus emphasizing the need for thorough characterization of any genetically modified material obtained through CRISPR-mediated gene editing before further functional studies or therapeutic use.

Las técnicas de ingeniería genética convencionales generan modificaciones en el genoma a través de la integración estable de elementos de ADN que no ocurren naturalmente bajo esa combinación. Por lo tanto, los organismos resultantes y (la mayoría) de los productos de los mismos pueden inequívocamente identificarse con métodos basados ​​en PCR específicos para eventos dirigidos al sitio de inserción. Las nuevas técnicas de generación, como la edición del genoma, diversifican la caja de herramientas para generar variabilidad en plantas. Varias de estas técnicas pueden introducir cambios de un solo nucleótido. sin integrar ADN extraño y, por lo tanto, generar organismos con los fenotipos deseados. En consecuencia, tales organismos y productos de los mismos pueden ser indistinguibles de los contrapartes existentes o criadas convencionalmente con herramientas analíticas establecidas. Las modificaciones pueden parecerse por completo a mutaciones aleatorias independientemente de que sean espontáneas o inducida químicamente o por irradiación. Por lo tanto, si una identificación de estos organismos o productos de los mismos, surgirá un nuevo desafío para las semillas, alimentos y piensos laboratorios de pruebas e instituciones de aplicación. Para una consideración detallada, distinguimos entre la detección de alteraciones de secuencia, independientemente de su origen, la identificación del proceso que generó una modificación específica y la identificación de un genotipo, es decir, un organismo producido por la edición del genoma que lleva una alteración genética específica en un ambiente conocido. Este artículo revisa brevemente la detección actual y futura y las estrategias de identificación (incluido el uso de enfoques bioinformáticos y estadísticos) en particular para plantas desarrolladas con técnicas de edición del genoma

Conventional genetic engineering techniques generate modifications in the genome via stable integration of DNA elements which do not occur naturally in this combination. Therefore, the resulting organisms and (most) products thereof can unambiguously be identified with event-specific PCR-based methods targeting the insertion site. New breeding techniques such as genome editing diversify the toolbox to generate genetic variability in plants. Several of these techniques can introduce single nucleotide changes without integrating foreign DNA and thereby generate organisms with intended phenotypes. Consequently, such organisms and products thereof might be indistinguishable from naturally occurring or conventionally bred counterparts with established analytical tools. The modifications can entirely resemble random mutations regardless of being spontaneous or induced chemically or via irradiation. Therefore, if an identification of these organisms or products thereof is demanded, a new challenge will arise for (official) seed, food, and feed testing laboratories and enforcement institutions. For detailed consideration, we distinguish between the detection of sequence alterations – regardless of their origin – the identification of the process that generated a specific modification and the identification of a genotype, i.e., an organism produced by genome editing carrying a specific genetic alteration in a known background. This article briefly reviews the existing and upcoming detection and identification strategies (including the use of bioinformatics and statistical approaches) in particular for plants developed with genome editing techniques.

Las técnicas de edición de genes nuevas y emergentes hacen posible apuntar a genes específicos en especies con mayor velocidad y especificidad que antes. De gran relevancia para el fitomejoramiento, los reguladores y los científicos están discutiendo cómo regular los productos desarrollados utilizando estas técnicas de edición de genes. Dichas discusiones incluyen si adoptar o adaptar el marco actual para la gobernanza de riesgos de OGM al evaluar los impactos de las plantas modificadas genéticamente y los productos derivados en el medio ambiente, la salud humana y animal y la sociedad. La clasificación o definición de productos es uno de varios aspectos del marco actual que se critica. Además, las brechas de conocimiento relacionadas con las evaluaciones de riesgo de los organismos editados por genes, por ejemplo, los efectos objetivo y no objetivo de la intervención en los genomas de las plantas, también son motivo de preocupación. Resolver estos y otros aspectos relacionados del marco actual implicará abordar muchas posiciones subjetivas cargadas de valor, por ejemplo, cómo especificar objetivos de protección a través de enfoques de servicios ecosistémicos. Un proceso informado por prácticas responsables de investigación e innovación, que involucre a una comunidad más amplia de personas, organizaciones, expertos y grupos de interés, podría ayudar a los científicos, reguladores y otras partes interesadas a abordar estas preocupaciones complejas y cargadas de valor relacionadas con la edición de genes de plantas con y para la sociedad.

New and emerging gene-editing techniques make it possible to target specific genes in species with greater speed and specificity than previously possible. Of major relevance for plant breeding, regulators and scientists are discussing how to regulate products developed using these gene-editing techniques. Such discussions include whether to adopt or adapt the current framework for GMO risk governance in evaluating the impacts of gene-edited plants, and derived products, on the environment, human and animal health and society. Product classification or definition is one of several aspects of the current framework being criticized. Further, knowledge gaps related to risk assessments of gene-edited organisms—for example of target and off-target effects of intervention in plant genomes—are also of concern. Resolving these and related aspects of the current framework will involve addressing many subjective, value-laden positions, for example how to specify protection goals through ecosystem service approaches. A process informed by responsible research and innovation practices, involving a broader community of people, organizations, experts, and interest groups, could help scientists, regulators, and other stakeholders address these complex, value-laden concerns related to gene-editing of plants with and for society.

El rápido surgimiento de nuevas biotecnologías para alterar selectivamente el material genético —la llamada edición del genoma— ha suscitado una controversia pública sobre cómo se debe regular su desarrollo y aplicación en los campos ambientales. Dado que el uso de estas nuevas tecnologías alberga no solo un potencial considerable, sino también riesgos de daños graves cuya ocurrencia es incierta debido a su aplicación en sistemas ambientales complejos, muchas autoridades legales nacionales e internacionales se adhieren actualmente a políticas de precaución. Sin embargo, según los críticos, las medidas cautelares y el principio jurídico de precaución en el que se basan son indebidamente restrictivas en el caso de las nuevas biotecnologías, lo que dificulta el avance tanto en la investigación como en diversos campos de aplicación. Al mismo tiempo, las nociones legales de precaución son muy ambiguas dentro y entre diferentes formulaciones nacionales e internacionales, lo que complica aún más la controversia sobre sus implicaciones. Este artículo va más allá del concepto de precaución tal como se encuentra en el derecho ambiental al examinar el significado ético y la ética justificación de las medidas cautelares en el ámbito ambiental. En particular, aclara el criterio del daño potencial, elimina la ambigüedad de los diferentes tipos de bases epistémicas en las decisiones de precaución y considera la relevancia y las implicaciones de las diferentes teorías del riesgo ético en cuanto a su respuesta a la incertidumbre y vaguedad epistémica. Las dos conclusiones principales son que, en primer lugar, independientemente de la teoría del riesgo ético adoptada, existe una obligación ética de tomar medidas de precaución siempre que sea posible un daño grave y la probabilidad de que ocurra un daño epistémicamente incierta o vaga. En cuanto a la evaluación del riesgo, se argumenta que la carga de la prueba no recae en quienes temen la ocurrencia de daños ambientales graves. Bastante, corresponde a aquellos cuyas acciones suscitan tales temores demostrar que un daño grave es extremadamente improbable o científicamente absurdo. En segundo lugar, la responsabilidad moral de determinar las situaciones de precaución y especificar las medidas de precaución apropiadas se atribuye no solo a las autoridades estatales, sino también a los actores industriales, así como a las comunidades de investigación. Sobre la base de estas dos conclusiones, se dan recomendaciones sobre cómo se debe incorporar el principio de precaución en la toma de decisiones políticas y jurídicas.

The rapid emergence of new biotechnologies for selectively altering genetic material—so-called genome editing—has sparked public controversy about how their development and application in the environmental fields are to be regulated. Since the use of these new technologies harbors not only considerable potential but also risks of serious damage whose occurrence is uncertain due to their application in complex environmental systems, many national and international legal authorities are currently adhering to policies of precaution. According to critics, however, precautionary measures and the legal principle of precaution on which they are based are unduly restrictive in the case of the new biotechnologies, hindering advancements in both research and various fields of application. At the same time, legal notions of precaution are highly ambiguous within and across different national and international formulations, thereby further complicating the controversy about their implications. This paper goes beyond the concept of precaution as found in environmental law by examining the ethical significance and the ethical justification of precautionary measures in the environmental field. In particular, it clarifies the criterion of potential damage, disambiguates different types of epistemic bases in precaution decisions, and considers the relevance and implications of different ethical risk theories as to their response to epistemic uncertainty and vagueness. The two main conclusions are that, first, irrespective of the ethical risk theory embraced, there is an ethical obligation to take precautionary measures whenever serious damage is possible and the probability of damage occurring epistemically uncertain or vague. Regarding the risk assessment, it is argued that the burden of proof lies not with those who fear the occurrence of serious environmental damage. Rather, it is up to those whose actions give rise to such fears to demonstrate that serious damage is extremely improbable or scientifically absurd. Second, the moral responsibility to determine precaution situations and to specify appropriate precautionary measures is attributed not only to state authorities but also to industrial players as well as research communities. Based on these two conclusions, recommendations are given as to how the precautionary principle should be incorporated in political and legal decision-making.

CRISPR – Cas9 está posicionado para convertirse en la herramienta de edición genética de elección en contextos clínicos. Hasta ahora, la exploración de las alteraciones genéticas inducidas por Cas9se ha limitado a la inmediata proximidad del sitio blanco y a secuencias distales fuera del objetivo, lo que llevaba a la conclusión de que CRISPR – Cas9 era razonablemente específico. Aquí se informa sobre eventos de mutagénesis significativa en el sitio blanco, tales como eliminaciones grandes y reordenamientos genómicos más complejos en los sitios blanco en células madre embrionarias de ratón, progenitores hematopoyéticos de ratón y en una línea celular diferenciada humana. Usar la secuenciación de lecturas largas y genotipificación por PCR de amplio espectro, mostró que las rupturas de ADN mediadas Cas9 con ARN de guía única frecuentemente resultan en eliminaciones que se extienden más allá de muchas kilobases. Además, se identificaron lesiones distantes al sitio de corte y eventos cruzados. El daño genómico observado en células mitóticamente activas causado por la edición con CRISPR / Cas9 puede tener consecuencias patógenas.

CRISPR–Cas9 is poised to become the gene editing tool of choice in clinical contexts. Thus far, exploration of Cas9-induced genetic alterations has been limited to the immediate vicinity of the target site and distal off-target sequences, leading to the conclusion that CRISPR–Cas9 was reasonably specific. Here we report significant on-target mutagenesis, such as large deletions and more complex genomic rearrangements at the targeted sites in mouse embryonic stem cells, mouse hematopoietic progenitors and a human differentiated cell line. Using long-read sequencing and long range PCR genotyping, we show that DNA breaks introduced by single-guide RNA/Cas9 frequently resolved into deletions extending over many kilobases. Furthermore, lesions distal to the cut site and crossover events were identified. The observed genomic damage in mitotically active cells caused by CRISPR–Cas9 editing may have pathogenic consequences.

CRISPR/Cas9 acelera el desarrollo de impulsores genéticos sintéticos para propagarse rápidamente para la modificación genética entre especies objetivo. Tanto en la Academia como en la Política, el uso de los impulsores genéticos por CRISPR/Cas9 para controlar potencialmente vectores de enfermedades, plagas de plantas o especies exóticas invasoras es controvertido, como lo ejemplificó la última Conferencia de las Partes de la Convención de las Naciones Unidas sobre la Biodiversidad (CDB) y la reunión más reciente de su grupo de expertos científicos en biología sintética (Grupo de expertos técnicos ad hoc / AHTEG). Mientras que algunos argumentan que los marcos actuales de evaluación de riesgos pueden acomodar a los impulsores genéticos sintéticos, otros piden una moratoria debido al impacto potencialmente perjudicial de las unidades genéticas en la vida silvestre. En esencia, la pregunta es si tenemos suficiente experiencia y conocimiento para manejar esta tecnología de manera segura. La experiencia y el conocimiento, a su vez, dependen del grado de continuidad y la novedad de los organismos de transmisión génica sintéticos (GDO), en comparación con los organismos modificados genéticamente existentes (OGM). Si bien los impulsores genéticos existen en la naturaleza, encontramos que los GDO difieren de los OGM actualmente liberados en cinco niveles. Una comprensión y análisis claros de estas diferencias es crucial para cualquier evaluación de riesgos y una evaluación ética y socialmente aceptable que es vital para la aplicación de esta tecnología.

CRISPR/Cas accelerates the development of synthetic gene drive organisms to quickly spread a genetic modification among the target species. Both in academia and politics, the use of CRISPR/Cas gene drive to potentially control disease vectors, plant pests or invasive alien species is controversial, as exemplified by the last Conference of the Parties of the United Nations Convention on Biodiversity (CBD) and the most recent meeting of its scientific expert group on synthetic biology (Ad Hoc Technical Expert Group/AHTEG). While some argue that current risk assessment frameworks can accommodate synthetic gene drives, others call for a moratorium owing to gene drives  potentially detrimental impact on wildlife. In essence, the question is whether we have sufficient experience and knowledge to handle this technology safely. Experience and knowledge in turn depend on the degree of continuity and novelty of synthetic gene drive organisms (GDO), compared to existing genetically modified organisms (GMO). While gene drives exist in nature, we find that GDO differ from the currently released GMO on five levels. A clear understanding and analysis of these differences is crucial for any risk assessment regime and a socially acceptable and ethical evaluation that is vital for the application of this technology.

CRISPR/Cas9 está preparado para convertirse en la herramienta de edición genética elegida en contextos clínicos. Hasta hora, la exploración de las alteraciones genéticas inducidas con Cas9 se ha limitad a la proximidad inmediata del sitio diana y las secuencias distales fuera del objetivo, lo que lleva a la conclusión de que CRISPR/Cas9 fue razonablemente específico. Reportamos una significativa mutagenesis en el objetivo como grandes deleciones y reordenamientos genómicos más complejos en los sitios objetivo en células troncales embrionarias de ratón, progenitores hematopoyéticos de ratón y una línea celular humana diferenciada. Usando tecnología de secuencia de lectura larga y el genotipado por PCR de largo alcance, mostramos que las roturas de ADN introducidas por la guía única de ARN/Cas9 se resuelven con frecuencia en deleciones que se extienden a lo largo de muchas kilobases. Además, se identificaron lesiones distales al sitio de corte y eventos de cruce. El daño genómico observado en las células mitóticamente activas ocasionadas por la edición CRISPR/Cas9 puede tener consecuencias patógenas.

CRISPR/Cas9 is poised to become the gene editing tool of choice in clinical contexts. Thus far, exploration of Cas9-induced genetic alterations has been limited to the immediate vicinity of the target site and distal off-target sequences, leading to the conclusion that CRISPR/Cas9 was reasonably specific. Here we report significant on-target mutagenesis such as large deletions and more complex genomic rearrangements at the targeted sites in mouse embryonic stem cells, mouse hematopoietic progenitors and a human differentiated cell line. Using long-read sequencing and long-range PCR genotyping, we show that DNA breaks introduced by single-guide RNA/Cas9 frequently resolved into deletions extending over many kilobases. Furthermore, lesions distal to the cut site and cross-over events were identified. The observed genomic damage in mitotically active cells caused by CRISPR/Cas9 editing may have pathogenic consequences.

CRISPR/Cas9 ha revolucionado nuestra habilidad para diseñar genomas y conducir asociaciones de genomas completos en células humanas. Mientras que algunos tipos de células son susceptibles a la ingeniería genómica, los genomas de células troncales pluripotentes humanas (hPSCs) han sido difíciles de diseñar, con eficiencias reducidas en relación a líneas celulares tumorales o células troncales embrionarias de ratón. Aquí, utilizando líneas celulares troncales pluripotentes humanas con integración estable de Cas9 o administración transitoria de ribonucleoprooteínas-Cas9 (RNPs), logramos una inserción promedio o una eficiencia de eliminación (indel) superior al 80%. Esta alta eficiencia de inserciones y deleciones reveló que las roturas de doble cadena (DSB) inducidas por Cas9 son tóxicas y matan a la mayoría de las células troncales humanas pluripotentes. En estudios previos, la toxicidad de Cas9 en las células troncales humanas fue menos evidente debido a la baja eficiencia de transfección y, posteriormente a la baja inducción de roturas de doble cadena. La respuesta tóxica a estas últimas, fue dependiente de p53/TP53, de modo que la eficiencia de la modificación precisa del genoma en células troncales humanas con un gen de p53 de tipo silvestre se redujo considerablemente. Nuestros resultados indican que la toxicidad de Cas9 crea un obstáculo para el uso de alto rendimiento de CRISPR/Cas9 para la modificación del genoma y la detección en células troncales humanas. Además, como las células troncales pueden adquirir mutaciones de P5314, las terapias de reemplazo de células que utilizan células troncales con tecnología CRISPR/Cas9 deben proceder con precaución, y dichas células diseñadas deben ser monitoreadas para la función de p53.

CRISPR/Cas9 has revolutionized our ability to engineer genomes and conduct genome-wide screens in human cells1,2,3. Whereas some cell types are amenable to genome engineering, genomes of human pluripotent stem cells (hPSCs) have been difficult to engineer, with reduced efficiencies relative to tumour cell lines or mouse embryonic stem cells3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Here, using hPSC lines with stable integration of Cas9 or transient delivery of Cas9-ribonucleoproteins (RNPs), we achieved an average insertion or deletion (indel) efficiency greater than 80%. This high efficiency of indel generation revealed that double-strand breaks (DSBs) induced by Cas9 are toxic and kill most hPSCs. In previous studies, the toxicity of Cas9 in hPSCs was less apparent because of low transfection efficiency and subsequently low DSB induction3. The toxic response to DSBs was P53/TP53-dependent, such that the efficiency of precise genome engineering in hPSCs with a wild-type P53 gene was severely reduced. Our results indicate that Cas9 toxicity creates an obstacle to the high-throughput use of CRISPR/Cas9 for genome engineering and screening in hPSCs. Moreover, as hPSCs can acquire P53 mutations14, cell replacement therapies using CRISPR/Cas9-enginereed hPSCs should proceed with caution, and such engineered hPSCs should be monitored for P53