La introducción de deleciones de inserción (INDEL) mediante la vía de unión final no homóloga (NHEJ) subyace en la base mecánica de la edición del genoma dirigida por CRISPR-Cas9. La ablación genética selectiva con CRISPR-Cas9 se logra mediante la instalación de un codón de terminación prematura (PTC) de un INDEL que induce un cambio de marco que provoca la descomposición mediada por tonterías (NMD) del ARNm mutante. Aquí, al examinar el ARNm y los productos proteicos de los genes dirigidos por CRISPR en un panel de línea celular con presuntas inactivaciones genéticas, detectamos la producción de ARNm o proteínas extraños en ~50 % de las líneas celulares. Demostramos que estos productos de proteínas aberrantes provienen de la introducción de INDEL que promueven la entrada ribosómica interna, convierten los pseudo-ARNm (alternativamente, ARNm empalmados con un PTC) en moléculas que codifican proteínas, o inducir la omisión de exón mediante la interrupción de los potenciadores de empalme de exón (ESE). Nuestros resultados revelan desafíos para manipular los resultados de la expresión génica utilizando mutagénesis basada en INDEL y estrategias útiles para mitigar su impacto en los resultados previstos de la edición del genoma.

The introduction of insertion-deletions (INDELs) by non-homologous end-joining (NHEJ) pathway underlies the mechanistic basis of CRISPR-Cas9-directed genome editing. Selective gene ablation using CRISPR-Cas9 is achieved by installation of a premature termination codon (PTC) from a frameshift-inducing INDEL that elicits nonsense-mediated decay (NMD) of the mutant mRNA. Here, by examining the mRNA and protein products of CRISPR targeted genes in a cell line panel with presumed gene knockouts, we detect the production of foreign mRNAs or proteins in ~50% of the cell lines. We demonstrate that these aberrant protein products stem from the introduction of INDELs that promote internal ribosomal entry, convert pseudo-mRNAs (alternatively spliced mRNAs with a PTC) into protein encoding molecules, or induce exon skipping by disruption of exon splicing enhancers (ESEs). Our results reveal challenges to manipulating gene expression outcomes using INDEL-based mutagenesis and strategies useful in mitigating their impact on intended genome-editing outcomes.

En las últimas décadas, se han desarrollado técnicas de edición del genoma como CRISPR/Cas, TALEN, nucleasas con dedos de zinc, meganucleasas, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y edición de bases que permiten una modificación precisa de las secuencias de ADN. Estas técnicas brindan opciones para aplicaciones simples, que ahorran tiempo y son rentables en comparación con otras técnicas de mejoramiento y, por lo tanto, ya se ha promovido la edición del genoma para una amplia gama de especies de plantas. Aunque la aplicación de la edición del genoma induce menos modificaciones no deseadas (fuera de los objetivos) en el genoma en comparación con las técnicas clásicas de mutagénesis, los efectos fuera del objetivo son un punto importante de crítica, ya que se supone que causan efectos no deseados, por ejemplo, inestabilidad genómica o muerte celular. . Para abordar estos aspectos, este mapa pretende responder a la siguiente pregunta: ¿Cuál es la evidencia disponible para el rango de aplicaciones de la edición del genoma como una nueva herramienta para la modificación de rasgos de plantas y la posible ocurrencia de efectos secundarios asociados? Esta pregunta principal será considerada por dos preguntas secundarias: una tiene como objetivo revisar los rasgos orientados al mercado que se modifican mediante la edición del genoma en las plantas y la otra explora la aparición de efectos fuera del objetivo.

Within the last decades, genome-editing techniques such as CRISPR/Cas, TALENs, Zinc-Finger Nucleases, Meganucleases, Oligonucleotide-Directed Mutagenesis and base editing have been developed enabling a precise modification of DNA sequences. Such techniques provide options for simple, time-saving and cost-effective applications compared to other breeding techniques and hence genome editing has already been promoted for a wide range of plant species. Although the application of genome-editing induces less unintended modifications (off-targets) in the genome compared to classical mutagenesis techniques, off-target effects are a prominent point of criticism as they are supposed to cause unintended effects, e.g. genomic instability or cell death. To address these aspects, this map aims to answer the following question: What is the available evidence for the range of applications of genome-editing as a new tool for plant trait modification and the potential occurrence of associated off-target effects? This primary question will be considered by two secondary questions: One aims to overview the market-oriented traits being modified by genome-editing in plants and the other explores the occurrence of off-target effects.

Las técnicas de ingeniería genética convencionales generan modificaciones en el genoma a través de la integración estable de elementos de ADN que no ocurren naturalmente en esta combinación. Por lo tanto, los organismos resultantes y (la mayoría) de los productos de los mismos pueden identificarse sin ambigüedades con métodos basados ​​en PCR para eventos específicos dirigidos al sitio de inserción. Las nuevas técnicas de mejoramiento, como la edición del genoma, diversifican la caja de herramientas para generar variabilidad genética en las plantas. Varias de estas técnicas pueden introducir cambios de nucleótidos individuales sin integrar ADN extraño y, por lo tanto, generar organismos con fenotipos previstos. En consecuencia, tales organismos y los productos de los mismos pueden ser indistinguibles de sus contrapartes naturales o criadas convencionalmente con herramientas analíticas establecidas. Las modificaciones pueden parecerse completamente a mutaciones aleatorias, independientemente de que sean espontáneas o inducidas químicamente o mediante irradiación. Por lo tanto, si se exige una identificación de estos organismos o sus productos, surgirá un nuevo desafío para los laboratorios (oficiales) de análisis de semillas, alimentos y piensos y las instituciones encargadas de hacer cumplir la ley. Para una consideración detallada, distinguimos entre la detección de alteraciones de la secuencia, independientemente de su origen, la identificación del proceso que generó una modificación específica y la identificación de un genotipo, es decir, un organismo producido por edición del genoma que lleva una alteración genética específica en un antecedentes conocidos. Este artículo revisa brevemente las estrategias de detección e identificación existentes y futuras (incluido el uso de bioinformática y enfoques estadísticos), en particular para las plantas desarrolladas con técnicas de edición del genoma.

Conventional genetic engineering techniques generate modifications in the genome via stable integration of DNA elements which do not occur naturally in this combination. Therefore, the resulting organisms and (most) products thereof can unambiguously be identified with event-specific PCR-based methods targeting the insertion site. New breeding techniques such as genome editing diversify the toolbox to generate genetic variability in plants. Several of these techniques can introduce single nucleotide changes without integrating foreign DNA and thereby generate organisms with intended phenotypes. Consequently, such organisms and products thereof might be indistinguishable from naturally occurring or conventionally bred counterparts with established analytical tools. The modifications can entirely resemble random mutations regardless of being spontaneous or induced chemically or via irradiation. Therefore, if an identification of these organisms or products thereof is demanded, a new challenge will arise for (official) seed, food, and feed testing laboratories and enforcement institutions. For detailed consideration, we distinguish between the detection of sequence alterations – regardless of their origin – the identification of the process that generated a specific modification and the identification of a genotype, i.e., an organism produced by genome editing carrying a specific genetic alteration in a known background. This article briefly reviews the existing and upcoming detection and identification strategies (including the use of bioinformatics and statistical approaches) in particular for plants developed with genome editing techniques

La cuestión de si las nuevas técnicas de modificación genética (nGM) en el desarrollo de las plantas pueden tener efectos negativos no despreciables para el medio ambiente y/o la salud es importante para la discusión sobre su regulación. Sin embargo, el conocimiento actual para abordar este problema es limitado para la mayoría de los nGM, particularmente para los nGM desarrollados recientemente, como la edición del genoma y sus variaciones emergentes, por ejemplo, la edición de base. Esto genera incertidumbres con respecto al estado de riesgo/seguridad de las plantas que se desarrollan con una amplia gama de diferentes nGM, especialmente la edición del genoma, y otros nGM como la cisgénesis, el transjerto, la inducción de haploides o la reproducción inversa. Se realizó una encuesta de literatura para identificar plantas desarrolladas por nGM que sean relevantes para el uso agrícola futuro. Estas plantas nGM se analizaron en busca de peligros asociados (i) con sus rasgos desarrollados y su uso o (ii) con cambios no deseados resultantes de los nGM u otros métodos aplicados durante el mejoramiento. Es probable que varios rasgos se vuelvan particularmente relevantes en el futuro para las plantas nGM, a saber, la resistencia a los herbicidas (HR), la resistencia a diferentes patógenos de las plantas, así como la modificación de la composición, morfología, aptitud (por ejemplo, mayor resistencia al frío/heladas, sequía o salinidad), o características reproductivas modificadas. Algunas características, como la resistencia a ciertos herbicidas, ya se conocen de los cultivos GM existentes y sus evaluaciones anteriores identificaron problemas y/o riesgos, como el desarrollo de malezas resistentes a los herbicidas. Otros rasgos en las plantas nGM son nuevos; lo que significa que no están presentes en las plantas agrícolas cultivadas actualmente con un historial de uso seguro, y sus mecanismos fisiológicos subyacentes aún no están suficientemente dilucidados. Las características de algunas aplicaciones de edición del genoma, por ejemplo, la pequeña extensión del cambio de secuencia genómica y su mayor eficiencia de orientación, es decir, la precisión, no pueden considerarse una indicación de seguridad per se, especialmente en relación con los nuevos rasgos creados por dichas modificaciones. Todos los nGM considerados aquí pueden provocar cambios no deseados de diferentes tipos y frecuencias. Sin embargo, el rápido desarrollo de plantas nGM puede comprometer la detección y eliminación de efectos no deseados. Por lo tanto, se debe realizar una evaluación de riesgos previa a la comercialización específica del caso para las plantas nGM, incluida una caracterización molecular apropiada para identificar cambios no deseados y/o confirmar la ausencia de secuencias transgénicas no deseadas.

The question whether new genetic modification techniques (nGM) in plant development might result in non-negligible negative effects for the environment and/or health is significant for the discussion concerning their regulation. However, current knowledge to address this issue is limited for most nGMs, particularly for recently developed nGMs, like genome editing, and their newly emerging variations, e.g., base editing. This leads to uncertainties regarding the risk/safety-status of plants which are developed with a broad range of different nGMs, especially genome editing, and other nGMs such as cisgenesis, transgrafting, haploid induction or reverse breeding. A literature survey was conducted to identify plants developed by nGMs which are relevant for future agricultural use. Such nGM plants were analyzed for hazards associated either (i) with their developed traits and their use or (ii) with unintended changes resulting from the nGMs or other methods applied during breeding. Several traits are likely to become particularly relevant in the future for nGM plants, namely herbicide resistance (HR), resistance to different plant pathogens as well as modified composition, morphology, fitness (e.g., increased resistance to cold/frost, drought, or salinity) or modified reproductive characteristics. Some traits such as resistance to certain herbicides are already known from existing GM crops and their previous assessments identified issues of concern and/or risks, such as the development of herbicide resistant weeds. Other traits in nGM plants are novel; meaning they are not present in agricultural plants currently cultivated with a history of safe use, and their underlying physiological mechanisms are not yet sufficiently elucidated. Characteristics of some genome editing applications, e.g., the small extent of genomic sequence change and their higher targeting efficiency, i.e., precision, cannot be considered an indication of safety per se, especially in relation to novel traits created by such modifications. All nGMs considered here can result in unintended changes of different types and frequencies. However, the rapid development of nGM plants can compromise the detection and elimination of unintended effects. Thus, a case-specific premarket risk assessment should be conducted for nGM plants, including an appropriate molecular characterization to identify unintended changes and/or confirm the absence of unwanted transgenic sequences.

Los impulsores genéticos son modificaciones genéticas diseñadas para difundir rápidamente rasgos en una población objetivo. Actualmente se proponen como agentes de control biológico para combatir, por ejemplo, las especies exóticas invasoras y los vectores de enfermedades transmisibles. También se plantean preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la diversidad biológica. Este texto evalúa la gobernanza de los impulsores genéticos en el marco del Convenio sobre la Diversidad Biológica (CDB) y su Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad. Si bien los impulsores genéticos son directamente relevantes para los objetivos de ambos acuerdos, sus marcos regulatorios no han seguido el ritmo del cambio tecnológico. El enfoque de este artículo es el análisis de las lagunas e inconsistencias dentro de ambos acuerdos. Se destacan numerosos elementos del CDB y el Protocolo de Cartagena que plantean desafíos para la gobernanza de los impulsores genéticos, como cuestiones relacionadas con el alcance regulatorio, los movimientos transfronterizos, la precaución y las especies exóticas invasoras.

Gene drives are genetic modifications designed for rapidly diffusing traits throughout a target population. They are currently being proposed as biological control agents to combat, for instance, invasive alien species and disease vectors. They also raise concerns regarding their potential adverse effects on biological diversity. This text assesses gene drive governance under the Convention on Biological Diversity (CBD) and its Cartagena Protocol on Biosafety. While gene drives are directly relevant for the objectives of both agreements, their regulatory frameworks have not kept up with the pace of technological change. The focus of this article is on the analysis of gaps and inconsistencies within both agreements. It highlights numerous elements of the CBD and the Cartagena Protocol that raise challenges for gene drive governance, such as matters related to regulatory scope, transboundary movements, precaution and invasive alien species.

n comparación con las liberaciones anteriores de organismos genéticamente modificados (OGM) que eran principalmente plantas, los impulsores genéticos representan un cambio de paradigma en el manejo de OGM: la regulación actual de la liberación de OGM supone que durante períodos específicos de tiempo se liberará una cierta cantidad de OGM en una región en particular. Sin embargo, ahora surge un tipo de tecnología genética cuyo principio más íntimo reside en superar estos límites: la transformación o incluso la erradicación de poblaciones silvestres. El carácter invasivo de los impulsores genéticos exige un análisis exhaustivo de sus funcionalidades, fiabilidad e impacto potencial. Pero tales investigaciones se ven obstaculizadas por el hecho de que una prueba de campo experimental difícilmente sería reversible. Por lo tanto, una evaluación prospectiva adecuada es de suma importancia para una estimación del riesgo potencial asociado con la aplicación de impulsores genéticos. Este trabajo está destinado a respaldar la inevitable caracterización de los impulsores genéticos mediante un enfoque comparativo de evaluación de tecnología prospectiva con un enfoque en las posibles fuentes de riesgo. Allí, se abordan el peligro y el potencial de exposición, así como las incertidumbres con respecto al rendimiento de los impulsores genéticos sintéticos. Además, un análisis cuantitativo de su invasividad debería permitir una evaluación diferenciada de su poder para transformar poblaciones silvestres.

Compared to previous releases of genetically modified organisms (GMOs) which were primarily plants, gene drives represent a paradigm shift in the handling of GMOs: Current regulation of the release of GMOs assumes that for specific periods of time a certain amount of GMOs will be released in a particular region. However, now a type of genetic technology arises whose innermost principle lies in exceeding these limits—the transformation or even eradication of wild populations. The invasive character of gene drives demands a thorough analysis of their functionalities, reliability and potential impact. But such investigations are hindered by the fact that an experimental field test would hardly be reversible. Therefore, an appropriate prospective assessment is of utmost importance for an estimation of the risk potential associated with the application of gene drives. This work is meant to support the inevitable characterization of gene drives by a comparative approach of prospective technology assessment with a focus on potential sources of risk. Therein, the hazard and exposure potential as well as uncertainties with regard to the performance of synthetic gene drives are addressed. Moreover, a quantitative analysis of their invasiveness should enable a differentiated evaluation of their power to transform wild populations.

La tecnología de impulsores genéticos (gene drives) podría permitir la propagación intencional de un gen deseado a través de una población silvestre entera en relativamente pocas generaciones. Sin embargo, existe una gran preocupación de que los impulsores genéticos no se propaguen o se propaguen sin restricciones más allá de la población objetivo. La solución potencial es utilizar unidades dependientes del umbral más localizadas, que solo se propagan cuando se liberan en una población por encima de un nivel crítico. frecuencia. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, pequeños cambios en la aptitud del impulsor genético podrían conducir a resultados divergentes en el comportamiento de propagación. Ante la incertidumbre ecológica, la incapacidad de estimar la aptitud de los impulsos genéticos en el contexto fuera de laboratorio podría resultar problemática porque los impulsores genéticos diseñados para ser localizados podrían propagarse y fijarse en poblaciones vecinas si las condiciones ecológicas favorecen inesperadamente al impulsor genético. Esta perspectiva ofrece orientación a los desarrolladores y administradores porque sortear la diseminación y la capacidad de control del impulso genético podría ser arriesgado sin conocimiento detallado de los contextos ecológicos.

Gene drive technology could allow the intentional spread of a desired gene throughout an entire wild population in relatively few generations. However, there are major concerns that gene drives could either fail to spread or spread without restraint beyond the targeted population. One potential solution is to use more localized threshold-dependent drives, which only spread when they are released in a population above a critical frequency. However, under certain conditions, small changes in gene drive fitness could lead to divergent outcomes in spreading behavior. In the face of ecological uncertainty, the inability to estimate gene drive fitness in a real-world context could prove problematic because gene drives designed to be localized could spread to fixation in neighboring populations if ecological conditions unexpectedly favor the gene drive. This perspective offers guidance to developers and managers because navigating gene drive spread and controllability could be risky without detailed knowledge of ecological contexts.

La reciente divulgación de que un embrión humano fue sometido a una transformación genética utilizando el sistema CRISPR / cas9 dio lugar a varias preocupaciones sobre cuestiones éticas sobre su uso incontrolado en humanos. Aunque CRISPR / cas9 ha demostrado su eficacia, este sistema todavía carece de la capacidad para evitar la introducción de mutaciones no deseadas a través del genoma diana. En este escrito presentamos varios de los impactos indeseables que el sistema CRISPR / Cas9 tiene en la modificación genética del genoma humano. Se discuten brevemente, utilizando la literatura recientemente publicada en distintas revistas de alto impacto, las principales preocupaciones relacionadas con CRISPR / Cas9 frente a sus efectos no deseados y cómo lo ha abordado la comunidad científica.

The recent disclosure of a human embryo subjected to a genetic transformation using the CRISPR/cas9 system give rise to several concerns on ethical questions about its uncontrolled use in humans. Although CRISPR/cas9 has demonstrated its efficiency, this system still lacks the capability to avoid the introduction of undesirable mutations through the target genome. In this Letter, we present several undesirable impacts that CRISPR/cas9 system have in the genetic transformation of the human genome. We briefly discuss, using the very recent literature from distinct high impact journals, the main concerns related to CRISPR/cas9 to deal with off-target effects and how the research community has treated it.

Los temas éticos asociados con el uso de la ingeniería genética y de los impulsores genéticos en la conservación están típicamente descritos en la evaluación y manejo de riesgos, la participación y aceptación pública, costos de oportunidad, distribuciones de riesgos y beneficios, y omisiones. Todo lo anterior es importante, pero las preocupaciones éticas se extienden más allá de los temas previos porque el uso de la ingeniería genética tiene el potencial de alterar significativamente las prácticas, conceptos y compromisos de valor de la conservación. Busqué elucidar los temas éticos conectados con un enfoque potencial hacia la ingeniería genética en la conservación, y también proporcionar una estrategia para el análisis ético de las tecnologías novedosas para la conservación. Las razones principales ofrecidas como apoyo para el uso de la ingeniería genética y la transmisión de genes en la conservación son la eficacia y la necesidad de lograr los objetivos de conservación. La perspectiva ética instrumentalista asociada con estas razones involucra la evaluación de las tecnologías novedosas como medio para obtener los fines deseados. Para las poderosas tecnologías emergentes, la perspectiva instrumentalista necesita estar complementada con una perspectiva de forma de vida, la cual se aplica frecuentemente en la filosofía de la tecnología. La perspectiva de forma de vida involucra la consideración de cómo las tecnologías novedosas reestructuran las actividades a las cuales son introducidas. Cuando en la conservación se aplica la perspectiva de forma de vida a la ingeniería genética creativa, trae hacia el foco un conjunto de temas éticos, como aquellos asociados con el poder, el significado, las relaciones y los valores, que no captura la perspectiva instrumentalista. Esta perspectiva también ilustra sobre el por qué el uso de impulsores genéticos en la conservación es tan interesante ética y filosóficamente.

The ethical issues associated with using genetic engineering and gene drives in conservation are typically described as consisting of risk assessment and management, public engagement and acceptance, opportunity costs, risk and benefit distributions, and oversight. These are important, but the ethical concerns extend beyond them because the use of genetic engineering has the potential to significantly alter the practices, concepts, and value commitments of conservation. I sought to elucidate the broader set of ethical issues connected with a potential genetic engineering turn in conservation and provide an approach to ethical analysis of novel conservation technologies. The primary rationales offered in support of using genetic engineering and gene drives in conservation are efficiency and necessity for achieving conservation goals. The instrumentalist ethical perspective associated with these rationales involves assessing novel technologies as a means to accomplish desired ends. For powerful emerging technologies the instrumentalist perspective needs to be complemented by a form-of-life perspective frequently applied in the philosophy of technology. The form-of-life perspective involves considering how novel technologies restructure the activities into which they are introduced. When the form-of-life perspective is applied to creative genetic engineering in conservation, it brings into focus a set of ethical issues, such as those associated with power, meaning, relationships, and values, that are not captured by the instrumentalist perspective. It also illuminates why the use of gene drives in conservation is so ethically and philosophically interesting. 

La edición del genoma utilizando sistemas de endonucleasas diseñados (GEEN) se apoderó rápidamente del campo de la ciencia de plantas y fitomejoramiento. Hasta ahora, las técnicas de edición del genoma se han aplicado en más de cincuenta plantas diferentes, incluyendo especies modelo como Arabidopsis, los principales cultivos como el arroz, el maíz o el trigo, así como los cultivos económicamente menos importantes como la fresa, el maní y el pepino. Estas técnicas se han utilizado para la investigación básica como prueba de concepto o para investigar las funciones de los genes en la mayoría de sus aplicaciones. Sin embargo, se han atendido varios rasgos orientados al mercado, que incluyen características agronómicas mejoradas, mejor calidad de alimentos y piensos, mayor tolerancia al estrés abiótico y biótico y tolerancia a herbicidas. Estas tecnologías están evolucionando a un ritmo vertiginoso y, especialmente, el campo de la edición del genoma basado en CRISPR avanza increíblemente rápido. Los sistemas CRISPR derivados de una multitud de especies bacterianas se están utilizando para la edición de genes dirigida y ya se han aplicado muchas modificaciones a los sistemas CRISPR existentes, tales como (i) alterar su motivo adyacente de protoespaciador (ii) aumentar su especificidad (iii) alterar su habilidad para cortar ADN y (iv) fusionarlos con proteínas adicionales. Además, el sistema de transformación clásico que utiliza Agrobacteria tumefaciens o Rhizobium rhizogenes, y otras tecnologías de transformación ya están disponibles y hay otros métodos en camino hacia el sector de la plantas. Algunos de ellos están utilizando únicamente prooteinas o complejos de proteína-ARN para la transformación, haciendo posible alterar el genoma sin el uso de ADN recombinante. Debido a esto, es imposible que el ADN extraño se incorpore en el genoma del huésped. En esta revisión, presentaremos los desarrollos y técnicas recientes en el campo de la edición del genoma libre de ADN, sus ventajas y dificultades, y ofreceremos una perspectiva sobre las tecnologías que podrían estar disponibles en el futuro para la edición del genoma en plantas. Además, analizaremos estas técnicas a la luz de las regulaciones existentes y futuras potenciales.

Genome Editing using engineered endonuclease (GEEN) systems rapidly took over the field of plant science and plant breeding. So far, Genome Editing techniques have been applied in more than fifty different plants, including model species like Arabidopsis, main crops like rice, maize or wheat as well as economically less important crops like strawberry, peanut and cucumber. These techniques have been used for basic research as proof-of-concept or to investigate gene functions in most of its applications. However, several market-oriented traits have been addressed including enhanced agronomic characteristics, improved food and feed quality, increased tolerance to abiotic and biotic stress and herbicide tolerance. These technologies are evolving at a tearing pace and especially the field of CRISPR based Genome Editing is advancing incredibly fast. CRISPR-Systems derived from a multitude of bacterial species are being used for targeted Gene Editing and many modifications have already been applied to the existing CRISPR-Systems such as (i) alter their protospacer adjacent motif (ii) increase their specificity (iii) alter their ability to cut DNA and (iv) fuse them with additional proteins. Besides, the classical transformation system using Agrobacteria tumefaciens or Rhizobium rhizogenes, other transformation technologies have become available and additional methods are on its way to the plant sector. Some of them are utilizing solely proteins or protein-RNA complexes for transformation, making it possible to alter the genome without the use of recombinant DNA. Due to this, it is impossible that foreign DNA is being incorporated into the host genome. In this review we will present the recent developments and techniques in the field of DNA-free Genome Editing, its advantages and pitfalls and give a perspective on technologies which might be available in the future for targeted Genome Editing in plants. Furthermore, we will discuss these techniques in the light of existing  and potential future regulations.